真核微藻作为地球上主要的光合生物类群之一，真核微藻具有极其丰富多样的代谢功能。它们利用二氧化碳和水来高效合成油脂、色素、蛋白、多糖、抗体等高附加值化合物，是碳中和背景下和生物制造产业中极具发展潜力的“细胞工厂”。但是，长期以来，虽然大量真核微藻已经完成测序，但其基因组中通常仍有半数以上基因仍然功能未知。这一挑战问题严重限制了人们对微藻代谢功能的理解与利用，也阻碍了光驱合成生物技术的快速发展。

造成这一瓶颈的根本原因是受制于传统研究手段的局限。，一方面，常规化学或物理诱变因为突变位点随机、往往为多位点突变常见等，通常难以快速追溯突变，造成机制解析困难。另一方面，基于质谱或荧光流式的代谢功能筛选手段，要么依赖培养故极为耗时与繁琐，要么需荧光标记导致应用范围极为受限。因此，亟需一个单细胞精度、免荧光标记、高效建立代谢表型组与相应基因型关系的技术平台。

针对上述挑战，青岛能源所单细胞中心提出了全基因组编辑单基因突变体库耦合高通量拉曼流式分选的解决方案。进而以工业微藻（海洋微拟球藻）为研究模式，以类胡萝卜素合成机制为范例，建立了一个单细胞精度的正向遗传学方法平台。

全基因组编辑突变体库耦合拉曼流式分选高通量挖掘高产类胡萝卜素功能基因

在突变体库构建方面，研究团队利用CRISPR/Cas编辑系统构建了业界首个真核微藻全基因组CRISPR/Cas单基因敲除文库。首先，通过在载体中引入tRNA序列，保证了文库规模化制备的效率。同时，开发了一种高通量基因突变定位方法，能快速、精准地鉴定出每个突变体的基因型。这使得整个突变体库从传统的“基因型黑箱”转变为清晰可读的“基因型白箱”，为后续将单细胞代谢表型直接映射至对应基因型提供了信息基础。该微拟球藻文库包含3567株突变体，覆盖2397条有效的向导RNA（gRNA），具有基因覆盖度较高、突变分布均匀等特点，成为大规模挖掘“功能基因暗物质”的基础资源。

进而，团队基于与青岛星赛生物联合研制的高通量拉曼流式细胞分选仪（FlowRACS 3.0），对微藻文库进行单细胞精度、免荧光标记、非破坏性、高通量的代谢功能分选。拉曼光谱中，类胡萝卜素在约1509 cm⁻¹处的特征峰强度与其胞内含量呈线性关系，且几乎不受叶绿素背景干扰，故可准确定量胞内类胡萝卜素的总量。通过设定高目标含量阈值的流式拉曼分选，研究人员在数小时内即从全基因组单基因突变体库中分选出大量类胡萝卜素高产突变体细胞。

结合分选后细胞的高通量gRNA测序，研究人员鉴定出109个在类胡萝卜素高产突变细胞中富集的突变基因，涵盖类胡萝卜素生物合成、光合作用等20余条代谢通路。其中不仅包括已知的类胡萝卜素合成相关基因，如紫黄质脱环氧酶，还发现了此前从未与色素代谢关联的基因——蛋白酶体组装伴侣蛋白4（noPAC4）。纯培养突变株的功能验证表明，noPAC4通过两个潜在机制来调控类胡萝卜素合成基因：一是借助组蛋白去乙酰化酶（HDAC）参与表观遗传调控，二是通过26S蛋白酶体参与翻译后修饰。因此，敲除该基因可同时提升紫黄质、玉米黄质与β-胡萝卜素含量。这一前所未知之类胡萝卜素合成途径的发现，对于高值色素合成机制研究及相关产业具有重要意义。

总之，基于全基因组CRISPR/Cas单基因靶向突变体库与高通量拉曼流式细胞术，该研究建立了一个代谢功能靶向性高效挖掘基因突变的正向遗传学平台。它不依赖于基因序列的同源性，因此特别适合于挖掘全新的代谢功能与调控途径，而且广谱适用于细菌、真菌、植物、动物等所有细胞类型。下一步，该平台将应用于各个模式与非模式物种，加速“基因组功能暗物质”屏障的突破。

该研究工作由青岛能源所单细胞中心牵头，王勤涛副研究员、公衍海副研究员为论文共同第一作者；徐健研究员、王喜先研究员、马波研究员为论文的共同通讯作者。德国波茨坦大学的Zoran Nikoloski教授和法国原子能与替代能源委员会（CEA）的李永华研究员也参与了该研究完成。（文/王勤涛、图/刘阳）

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-026-74304-5