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青岛能源所研发出高耐久低成本的DNA合成纠错系统
2020-03-12 | 编辑: | 【 】| | 供稿部门:单细胞中心
    

  DNA的从头合成是合成生物技术的基础平台之一。但是,由于大规模DNA合成过程中难以避免地产生错误,DNA纠错环节的效率和经济性已经成为限制DNA合成质量、通量与成本的关键问题之一。针对此瓶颈,青岛能源所单细胞中心研发出高耐久低成本的DNA合成纠错系统,大幅度提高了DNA纠错环节的效率和经济性。该工作发表于ACS Synthetic Biology。

  就像我们写字一样,DNA合成是一个容易出错的过程。寡核苷酸的化学合成、DNA聚合酶的延伸、基于寡核苷酸的基因片段组装等大片段DNA合成的每一步骤均可能引入错误碱基。这些“错误”如果没有及时“纠正”,它们将随着核酸链的复制而传播和扩散,导致DNA合成产物中一般只有5%-60%具有完全正确的序列。因此,DNA纠错环节的效率和经济性已经成为限制DNA合成质量、通量与成本的关键问题之一。

  与其它的酶纠错系统相比,DNA错配修复蛋白(MutS)的纠错效率较高,而且使用相对简便。但在实际应用中,MutS酶活的持久性较差,在7天左右即开始显著下降,导致在一个完整的基因组合成流程中需要多次表达与纯化。这不仅阻碍了纠错环节的通量化和规模化,也限制了MutS纠错系统的工业化应用。

  针对这一瓶颈问题,单细胞中心张佳博士带领的攻关小组,首先,提出了基于搭建人工二硫键来提高酶活持久性的思路,根据MutS的X射线晶体结构,理性设计了10组可能显著提高蛋白质稳定性的二硫键,并从实验中筛选出最佳的组合。其次,通过与麦芽糖结合蛋白 (MBP)的融合表达,来提高MutS蛋白的异源表达量。最后,通过储存条件的优化,将MutS蛋白与纤维素结合挂柱并保存在四摄氏度,进一步提高了MutS的使用寿命。最终构建的名为iMICC的DNA合成纠错系统,在保证纠错性能的前提下,能够保持峰值酶活长达63天,因此不再需要频繁地重复制备新鲜的MutS。同时,成品挂柱的储存方式还大大提高了使用的便捷性。

  针对在溶液中合成Cas9同源基因和在芯片上合成木糖还原酶同源基因等的验证表明,iMICC能够将基因合成产物的错误率分别降低到0.64 / Kb和0.41 / Kb,组装成的正确片段占比72.1%和86.4%,而成本仅为$0.37/反应。因此,iMICC能够将基因合成过程中的碱基准确性提高37.6倍,同时大幅度提高了使用寿命。与常用的商品化纠错酶CorrectASE相比,iMICC的纠错性能高出6.6倍,却便宜了26.7倍。 

  因此,iMICC为建立一个更为简便、高效、稳定和低成本的工业化纠错流程奠定了基础。此外,这也是首次证明了二硫键的理性设计与搭建可以提高酶活的持久性,该思路为包括DNA纠错酶在内的诸多核酸工具酶的提质改性提供了有益启发。

  单细胞中心张佳博士是该论文的第一作者。该工作由单细胞中心徐健研究员主持完成,得到了研究所姚礼山研究员团队、赵广研究员团队和联川生物技术公司高晓连教授、李璐璐博士等的帮助。该研究获得了国家自然科学青年基金、杰青等项目的支持。(文/图 张佳)

  论文

  Zhang, J., Wang, Y. F., Chai, B. H., Wang, J. C., Li, L. L., Liu, M., Zhao, G., Yao, L. S., Gao, X. L., Yin, Y. F., and Xu, J*. (2020). Efficient and low-cost error removal in DNA synthesis by a high-durability MutS. ACS Synthetic Biology.

    文章链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00079

   

 
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